Im Tal des Mains ließen sich seit dem 5. Jahrhundert die Alemannen nieder. Später – im 6. und 7. Jahrhundert – besetzten die Franken das Land und um rund 650 wurde Würzburg der Herrschaftssitz des Königsgeschlechts der Merowinger. 689 sollen hier die drei Missionare Kilian, Kolonat und Totnan ermordet worden sein, welche dann später als Märtyrer kultisch verehrt wurden. Die erste urkundliche Erwähnung der Stadt geht auf das Jahr 704 zurück, in einer Schenkungsurkunde wurde von „castello Virteburch“ gesprochen. Im Mittelalter wurde in Würzburg um 1127 erstmals ein Ritterturnier auf deutschem Boden ausgetragen. Friedrich I. „Barbarossa“ heiratete in der Stadt seine zweite Frau und 1168 wurde Bischof Herold von eben jenem Barbarossa mit der Herzogswürde belehnt, worauf sich die Bischöfe von Würzburg von nun an Fürstbischöfe nennen konnten und den Titel „Herzog von Franken“ trugen.
1402 wurde die „Hohe Schule“ gegründet, ein Vorläufer der heutigen Julius-Maximilians Universität, wobei aus Geldmangel nur wenige Jahre später die Anstalt wieder geschlossen und erst im Zuge der Gegenreformation erneut eröffnet wurde. Im Bauernkrieg 1525 versuchten die Bauern die über der Stadt liegende Festung Marienberg zu erstürmen, was allerdings fehlschlug. Würzburg erlangte im Mittelalter leider traurige Berühmtheit als ein Schauplatz umfangreicher „Hexenverfolgungen“. Vom Ende des 16. bis in das 18. Jahrhundert hinein, wurden auf dem Gebiet des Hochstiftes Würzburg (daher im rund 6.000 km² großen Territorium, dass die Bischöfe von Würzburg beherrschten) mehr als 900 Menschen mit dem Vorwurf der Hexerei verbrannt, in der Stadt selbst waren es rund 200. Im Dreißigjährigen Krieg besetzten die Schweden von 1631 bis 34 die Stadt und richteten teilweise schwere Verwüstungen an. Die in der Folge der französischen Revolutionen durchgeführten Koalitionskriege brachten wiederum Besetzung und Zerstörung.
Final wurde 1803 im Reichdeputationshauptschluss, dem letzten bedeutenden Gesetz des Heiligen Römischen Reiches Deutscher Nation, das Hochstift Würzburg säkularisiert und der Großteil des Gebietes Bayern zugesprochen. Der Fürstbischoff war von da an nur noch der Bischoff Würzburgs. Zwar wurde 1805 durch die Friedensverträge von Preßburg nochmals ein Großherzogtum Würzburg gegründet, das überlebte die Beschlüsse des Wiener Kongresses jedoch nicht und fiel 1814 wieder an Bayern zurück. Zukünftig residierte der bayrische Kronprinz in der Stadt. 1817 wurde Würzburg die Hauptstadt des neu geschaffenen Untermainkreises, der später in den Regierungsbezirk Unterfranken aufging und noch heute als Verwaltungseinheit in Bayern besteht. Auch wenn die Industrialisierung, die Stadt nicht in eine Großstadt verwandelte (das geschah erst 1933) so ist eine revolutionäre Entdeckung in Würzburg gemacht wurden; die von Wilhelm Conrad Röntgen 1895 beobachtete Röntgenstrahlung. In der Zeit des Nationalsozialismus spielte Würzburg und besonders der hiesige Arzt, Werner Heyde, eine traurige Rolle. Es handelt sich um die Aktion T4, daher die Ermordung von geistig und körperlich behinderten Menschen, dessen Zentrale an der Universität stand. Durch einen Bombenangriff 1945 wurden weite Teile der Innenstadt zerstört. An diesem 16.März kamen rund 5.000 Menschen ums Leben. Die Stadt verlor im Zuge der Zerstörung weitere 50% ihrer Einwohner, doch schon etwa 10 Jahre später erreichte sie wieder das Vorkriegsniveau. Heute ist sie 6. größte Stadt Bayerns, hat 26.000 Studenten und ist damit eine der klassischen deutschen Universitätsstädte wie Heidelberg, Marburg, Göttingen oder Tübingen.